G蛋白偶联受体激酶4在骨骼肌多巴胺D_1受体降低胰岛素抵抗及血管平滑肌AT_1受体导致血管反应性增高中的作用及机制

【摘要】1.骨骼肌G蛋白偶联受体激酶4调节多巴胺D1受体在运动降低胰岛素抵抗中的作用及机制胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)是2型糖尿病最重要的发病机制和特点之一。此外,胰岛素抵抗同样是高血压、冠心病和脑卒中等多种心血管疾病的独立危险因素。各种心血管疾病和胰岛素抵抗之间相互作用,形成恶性循环而危害机体的健康。因此,改善生活方式和药物干预对胰岛素抵抗进行预防和控制是非常重要的。除了肝脏以外,肌肉组织是胰岛素作用最主要的靶器官。因此运动被认为是除了饮食控制和药物以外改善胰岛素抵抗最主要的治疗方法之一。运动对胰岛素抵抗的作用机制主要在于组织毛细血管数量增加,平衡血脂以及控制炎症因子和氧化应激。运动可运动可以显著的增高肾脏D1受体的表达,但对肌肉是否有相同的作用并不明确。前期研究显示,多巴胺D1受体在机体血糖及血胰岛素的调节中具有重要的作用。多巴胺D1受体激动剂非诺多泮(fenoldopam)和SKF38393均可改善2型糖尿病的胰岛素抵抗症状,但机制尚不明确。作为G蛋白偶联受体,多巴胺受体家族受到G蛋白偶联受体激酶(Gprotein-coupledreceptorkinase,GRK)家族的调节。GRKs与胰岛素抵抗具有密切的关系。而GRK4在胰岛素抵抗的发生中具有何种作用,尚不清楚。GRK4已被证实对于多巴胺D1受体功能具有重要的调节作用。因此,我们推测GRK4可能在骨骼肌上存在表达,并通过调节多巴胺D1受体,参与运动对胰岛素抵抗的调节。为证实上述假设,本实验采用了STZ和高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病小鼠模型,通过体内外实验相结合,以动物及骨骼肌C2C12细胞为研究对象,研究：(1)多巴胺D1受体在骨骼肌的表达情况；(2)骨骼肌多巴胺D1受体在运动改善IR中的作用；(3)多巴胺D1受体改善IR的信号通路；(4)骨骼肌上GRK4与巴胺D1受体的相互作用。1.1主要实验方法及步骤：1.1.1骨骼肌组织及细胞存在多巴胺D1受体的表达实验利用C57BL/6小鼠后肢股二头肌肌组织及小鼠骨骼肌前体细胞系C2C12细胞,利用免疫组织化学法以及免疫印迹法分别从形态学分布和蛋白水平分析多巴胺D1受体在骨骼肌组织及细胞上的分布情况。1.1.2骨骼肌多巴胺D1受体在运动改善IR中的作用实验利用C57BL/6小鼠和小鼠骨骼肌细胞系C2C12细胞,构建整体动物和骨骼肌细胞的胰岛素抵抗模型,通过C57BL/6小鼠在体运动实验及电刺激诱导的细胞收缩模型,在不同研究水平分析多巴胺D1受体对C2C12细胞胰岛素抵抗中的作用。1.1.3骨骼肌多巴胺D1受体对IR改善作用的信号通路本部分实验利用骨骼肌C2C12细胞构建细胞胰岛素抵抗模型,观察不同剂量和不同处理时间点多巴胺D1受体激动剂fenoldopam对骨骼肌C2C12细胞糖摄取的影响。检测多巴胺D1受体激动剂fenoldopam对Akt磷酸化程度的变化和GLUT4转位的变化。1.1.4骨骼肌GRK4对多巴胺D1受体的调节作用实验利用C57BL/6小鼠后肢股二头肌肌组织及小鼠骨骼肌前体细胞系C2C12细胞,利用免疫组织化学法以及免疫印迹法分别从形态学分布和蛋白水平分析GRK4在骨骼肌组织及细胞上的分布情况。并进一步分析GRK4和多巴胺D1受体在胰岛素抵抗情况及电刺激收缩情况下的相互关系。利用GRK4转基因小鼠的骨骼肌组织研究在GRK4活性增加的条件下,多巴胺D1受体表达量的改变。明确骨骼肌GRK4对多巴胺D1受体的调节作用。1.2主要研究成果：1.2.1多巴胺D1受体在骨骼肌组织及细胞上存在表达多巴胺D1受体在骨骼肌组织上存在表达,分布于骨骼肌肌纤维上1.2.2骨骼肌多巴胺D1受体在运动改善IR中的作用运动呈时间依赖性的降低2型糖尿病小鼠的血糖和血清胰岛素水平。血糖水平在运动2周出现显著下降,血清胰岛素水平在运动1至4周后均出现了显著下降,而1至4周的小鼠跑步机运动训练也降低了稳态胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。在跑步训练前连续给予SCH23390腹腔后,运动不能改善STZ及高脂饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠的高血糖和高胰岛素。STZ及高脂饮食诱导的胰岛素抵抗显著降低了小鼠骨骼肌多巴胺D1受体蛋白表达,而运动1至4周可显著增高小鼠骨骼肌多巴胺D1受体蛋白表达。在细胞水平,骨骼肌C2C12细胞胰岛素抵抗模型对葡萄糖的摄取能力显著下降,对葡萄糖的摄取随着15min至1h电刺激诱导的细胞被动收缩呈时间依赖性的增强。10-5M多巴胺D1受体抑制剂SCH23390阻断了高频电刺激引起骨骼肌C2C12细胞收缩诱导的葡萄糖摄入。多巴胺D1受体的膜表达与电刺激收缩呈时间依赖性的增强。1.2.3骨骼肌多巴胺D1受体对IR的改善作用依赖于Akt-Glut4信号通路骨骼肌C2C12细胞对葡萄糖的摄取量对fenoldpam呈剂量依赖性的增高；在短时刺激下,10-6M-10-5M的fenoldpam具有显著的作用；在长时刺激下,10-7M-10-5M的fenoldpam有显著作用。细胞Akt的磷酸化水平在使用胰岛素刺激后显著增加；而PA的处理对胰岛素的信号通路具有明确的损伤作用,无论是否利用胰岛素刺激均显著降低了Akt的磷酸化程度；而多巴胺D1受体激动剂fenoldpam可显著的提高Akt的磷酸化程度,这一作用并不依赖于胰岛素。GLUT4转位在胰岛素刺激后显著增加；而PA的处理对GLUT4转位具有明确的损伤作用,多巴胺D1受体激动剂fenoldpam通过增加GLUT4的膜表达增加糖转运。1.2.4骨骼肌GRK4对多巴胺D1受体的调节作用GRK4在骨骼肌组织及细胞上存在表达。而胰岛素抵抗状态下,GRK4的表达显著下降,短时间的骨骼肌细胞收缩不能改变GRK4的表达,但改变了GRK4与骨骼肌多巴胺D1受体的相互作用,增加了多巴胺D1受体的膜聚集。此外,GRK4活性增高可降低骨骼肌多巴胺D1受体的表达。1.3结论：1.3.1在骨骼肌组织及骨骼肌细胞上存在多巴胺D1受体的表达。1.3.2.长期运动可以增加骨骼肌上的多巴胺D1受体的蛋白表达,而急性的骨骼肌收缩可增加多巴胺D1受体的膜转位,增加受体敏感性；多巴胺D1受体参与了运动对胰岛素抵抗的调节作用。1.3.3.多巴胺D1受体通过调节Akt的磷酸化,增加葡萄糖转运体GLUT4的膜转位改善胰岛素抵抗。1.3.4.骨骼肌上存在GRK4;GRK4通过多巴胺D1受体参与对IR的调节。2.血管平滑肌G蛋白偶联受体激酶4增强AT1受体介导的血管收缩在高血压发病中的作用原发性高血压是脑卒中、心肌梗塞以及心肾功能衰竭等心血管疾病的重要危险因素。肾脏、血管和神经系统通过调节尿钠排泄、外周阻力和大血管弹性调节血压。大多数的激素和分泌因子通过G蛋白偶联受体(GPCRs)调节血压。G蛋白偶联受体激酶(GRK)功能异常导致了受体生理功能的异常,导致高血压的发生。GRK家族成员之一,GRK4具有固有活性,在特定组织表达。GRK4变异体65L、142V和486V在不同的人群中均与高血压发病有关。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAAS)的活性增高在高血压发病中具有重要的作用。在自发性高血压大鼠上,肾脏GRK4和AT1受体表达的共同升高导致了血压的升高。血管功能在血压和心功能调解中具有重要的作用。而GRK4是否通过AT1受体调节血管功能而参与血压的调节并不清楚。因此,本研究将就血管平滑肌上GRK4和AT1受体的相互作用进行研究。2.1主要实验方法及步骤：2.1.1GRK4在血管上的表达情况利用免疫荧光染色、免疫印迹实验和RT-PCR实验分析血管上GRK4的蛋白和mRNA的表达和分布情况。2.1.2GRK4.142V转基因小鼠血管反应性的改变在此部分实验中,我们将分析GRK4A142V转基因小鼠血管对AngⅡ以及坎地沙坦(ARB)收缩反应性的改变,以及GRK4A142V转基因小鼠血压的改变,并进一步分析GRK4A142V转基因小鼠血管AT1受体的表达变化情况。2.1.3GRK4变异体142V对血管平滑肌AT1受体表达及功能的影响在第三部分实验中,我们将对GRK4变异体A142V对血管收缩反应性作用的机制进行探讨。首先,本部分实验将观察AngⅡ对转染GRK4变异体A142V的平滑肌细胞内钙的刺激作用,以及坎地沙坦对其的抑制作用。进一步的研究将利用免疫印迹实验和RT-PCR实验分析GRK4变异体A142V对血管平滑肌蛋白和mRNA表达的作用；同时,也检测AT1受体蛋白降解和磷酸化水平的变化情况。此外,我们还利用免疫沉淀实验和激光共聚焦扫描分析GRK4和AT1受体的相互关系。作为AT1受体启动子的重要调节因子,我们还会分析不同基因型的血管平滑肌细胞NF-B和AT1受体启动子结合的改变,以及NF-B抑制剂BAY11-7082对AT1受体表达的改变。2.2主要研究成果：2.2.1GRK4在血管平滑肌上的表达情况首先,我们通过免疫荧光、免疫印迹及RT-PCR实验,证实GRK4在血管上存在表达。免疫荧光发现,GRK4在SD大鼠和C57BL/6J小鼠血管中膜和外膜存在表达。免疫印迹实验发现,GRK4存在54kDa,60kDa和65kDa三条条带,其中仅有60kDa的条带在使用GRK4特异性的siRNA干扰后出现减弱。RT-PCR显示GRK4mRNA存在表达。为进一步证实GRK4在血管外膜上存在表达,我们通过免疫印迹和RT-PCR实验证实了血管外膜的脂肪细胞和成纤维细胞存在GRK4表达。去除血管外膜后,不影响AngⅡ介导的血管收缩。2.2.2GRK4142V转基因小鼠血压及血管反应性的变化为分析GRK4调节AT1受体的作用,我们研究AT1受体的蛋白表达和功能在GRK4野生型和142V转基因小鼠上的区别。麻醉后的GRK4142V转基因小鼠的舒张压、收缩压和平均动脉压均高于野生型小鼠。给予小鼠静脉推注AngⅡ后,GRK4142V转基因小鼠的舒缩压增高也显著高于GRK.4野生型小鼠,而坎地沙坦对血压的降低作用在GRK4142V转基因小鼠的也显著强于GRK4野生型小鼠。该部分研究又进一步分析了AngⅡ对GRK4野生型和142V转基因小鼠血管反应性的影响。AngⅡ对GRK4.142V转基因小鼠血管收缩反应性的作用强于对GRK4野生型小鼠的作用。这一作用不受血管是否存在内皮的影响。在使用了10-6M的坎地沙坦处理血管后,血管收缩反应性在两种不同基因型小鼠上并无差别。AT1受体的表达在GRK4.142V转基因小鼠上显著高于GRK4野生型小鼠。2.2.3GRK4对血管平滑肌细胞AT1受体表达及功能的作用为进一步分析GRK4对AT1受体的影响,我们使用A10细胞转染hGRK4.142V变异体进行研究。AngⅡ诱导的细胞内钙增高在hGRK4.142V细胞上高于hGRK4野生型细胞。我们也同样发现,hGRK4.142V细胞上AT1受体蛋白和nRNA的表达显著高于hGRK4.野生型细胞；而AT1受体蛋白的降解在hGRK4.142V细胞上更低。此外,AT1受体磷酸化水平在hGRK4.142V细胞上低于hGRK4.野生型细胞。我们也分析了GRK4和AT1受体的共定位和共沉淀。GRK4和AT1受体的结合作用在在hGRK4.142V细胞上低于hGRK4野生型细胞,这可能是导致AT1受体磷酸化水平在hGRK4.142V细胞上的原因之一。作为AT1受体启动子活性的调控子,我们分析了NF-B与AT1受体启动子的结合作用,发现在hGRK4.142V细胞上NF-B与AT1受体启动子的结合作用强于hGRK4野生型细胞。而NF-B阻断剂BAY11-7082抑制了hGRK4.142V变异体对AT1受体蛋白的增加作用,提示NF-B在hGRK4.142V细胞上对AT1受体表达呈正向调节。2.3结论：2.3.1.GRK4在血管平滑肌上存在表达。2.3.2.GRK4变异体142V增强了AngⅡ诱导的血管收缩,导致血压升高。2.3.3.GRK4变异体142V增强了血管AT1受体的表达和功能,这是高血压发病中血管异常的原因之一。
【作者】陈垦；
【导师】曾春雨；
【作者基本信息】第三军医大学，内科学，2014，博士
【关键词】2型糖尿病；胰岛素抵抗；多巴胺D1受体；G蛋白偶联受体激酶4；糖转运；血管反应性；AT1受体；高血压；

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